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细胞色素C的制备及含量、活力测定

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发布时间:2020/5/18 10:53:13

    一、实验目的

    (1)通过细胞色序C的制备,了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤

    (2)掌握制备细胞色素C的操作技术及含量的测定方法

    二、实验原理

    细胞色素是一类含有铁 啉基团的电子传递蛋白,只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间,是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶,并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。结果表明,细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间;不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高,等电点为10.7,含铁量为0.38%~0.43%,Mr为12000~13000,猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。细胞色素C分为氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定,不易变性。pH 7.2~10.2, 100℃加热3分钟,细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%,若增加加热时间,氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定,可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的,因为比较稳定并易于保存。

    三、试剂与器材

    绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、玻璃柱、下口瓶、烧杯等。

    四、操作方法

    材料处理—提取—中和—吸附—洗脱—盐析—沉淀—透析—测定

    五、关键步骤与注意事项

    ① 吸附前必须把人造沸石处理好,装柱时避免柱内出现气泡,沿柱壁缓缓流入柱内。

    ② 洗脱时洗脱液一旦变白,立刻停止收集。洗脱完毕人造沸石可再生使用。

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