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远慕新闻:怎样从基因文库中选择合适的基因?

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发布时间:2020/4/22 10:35:22

    基因文库:是某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合。基因文库是通过纯化细胞总DNA,然后利用特定的限制性酶酶切产生能插入载体的片段,一般是λ替换载体、粘粒或者是YAC。

    对于植物、动物,所需要的克隆数很大,鉴定目的基因是一项艰巨的任务。对于这些生物体,可以使用细胞特异的cDNA文库。cDNA文库是将mRNA反转录成cDNA,插入载体中构建的文库。

    每一个细胞都含有相同的基因,但不同细胞中有的基因是表达的, 而有的基因关闭。只有少量基因在所有的细胞类型中都表达,利用mRNA构建的基因文库,只含有表达的部分基因。例如麸朊(醇溶朊),小麦中的一种营养蛋白,在正发育的种子中,以非常高的水平表达,大约占总mRNA的30%。

    克隆的鉴定方法

    筛选目的克隆最常用的方法是探针杂交法。

    探针是由目的基因的已知的信息决定的,有三种可能性:

    1) 目的基因在特定细胞中的丰度

    2) 基因所编码的蛋白质或者部分序列

    3) 基因是一个基因家族中的一个

    利用同源探针筛选目的克隆

    任意的两条单链核酸分子都有可能通过碱基配对结合,大部分的配对分子是不稳定的,因为只有少量的碱基配对。然而如果两条链是互补的,大部分碱基可以配对形成稳定的分子。不仅DNA间可以配对,DNA 与RNA间也可以进行配对。因此可以使用同源探针筛选目的克隆。

    如果克隆的基因所编码的蛋白已知。就可以利用遗传密码子预测相关基因的核苷酸序列,只有蛋氨酸和色氨酸无兼并密码,其他的氨基酸至少有两种密码子。例如丙氨酸有四种密码子,前两位是相同的,GCA,GCT,GCC,GCG,只能正确的预测两位的碱基。

    例如细胞色素C,从59号氨基酸的一段序列:Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met,相应的DNA序列是TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG,在18个碱基中有14个是可以预测的。如果用来杂交的18核苷酸的序列有上千种可能的排列,很显然不适合于合成探针。

    标记探针的方法有:

    缺刻平移(Nick translation)

    末端填充法(end-filling)

    随机引物法(详细见影音文件)

    杂交后通过放射自显影显示出来。放射性对操作者有害,而且废物对环境有污染,因此产生了一些新的方法。一种是生物素标记法,利用利用抗生物素蛋白,可以产生荧光,这种方法与放射性的敏感度相同。另外一种方法是将DNA与山葵过氧化酶连接,通过酶的活性降解发光氨产生化学荧光,直接在普通的照相底片上显示出来。

    菌落原位杂交

    杂交探针不仅可以鉴定细菌克隆也可以鉴定噬菌体形成的噬菌斑。

    首先将克隆或噬菌斑转移到纤维素膜或尼龙膜上,去掉所有的残留物,只留下DNA,这种处理同时导致了DNA变性,使双链的氢键断裂形成单链分子。通过80°C短时间处理,将DNA分子固定在膜上(纤维素膜);对于尼龙膜需要进行紫外交联,通过糖-磷酸中枢将分子连接到膜上。

    标记探针,加热变性,加入到杂交膜上进行杂交,然后洗去未结合的探针,干燥,接合探针的位置就可以检测出来。

    利用mRNA的丰度筛选cDNA文库

    形成中的种子的cDNA文库中,相当一部分克隆是gliadin基因。利用文库中的所有单个cDNA克隆作为探针,随机选取一个克隆,纯化重组DNA分子,标记成探针,与剩余的克隆进行杂交,选取不同的克隆作探针,直到有一个探针能与文库中的大部分克隆杂交,这种丰富的cDNA可能就是gliadin基因,然后进一步分析,通过测序,表达产物分析验证。

    利用异源探针可以鉴定相关的基因

    不同生物注册送体验金的网址同一蛋白的基因,有许多相同的序列,显示了进化中的保守性。利用相关基因的保守序列可以将不同生物中的基因克隆出来。例如酵母中细胞色素C探针可以将其他生物中的细胞色素C基因鉴定出来。当然实验条件需要调整,主要是降低退火的温度。

    异源探针还可以鉴定同一生物中相关的基因。

    利用抗体筛选cDNA表达文库

    除了杂交探针外,还可以选择免疫学筛选。杂交探针直接鉴定克隆的DNA片段,而免疫学方法鉴定的是克隆基因所表达的蛋白质。

    a) 抗体

    如果蛋白质样品注射进兔子体内,动物的免疫系统就会合成抗体结合、降解外来分子。在自然过程中,动物利用这种防御机制对付细菌、病毒和其他药品的入侵。

    当一种蛋白进入兔子体内,其血液中的抗体在随后的几天时间内保持较高的浓度,可以获得大量的纯化的抗体。

    b) 利用纯化的抗体检测重组克隆中的蛋白

    重组克隆转到聚乙烯膜上,裂解细胞,添加含有抗体的溶液,抗体本身是经过标记的,聚乙烯膜也要经过含有标记过的蛋白A溶液的冲洗,这样细菌的蛋白就会特异的结合到利用抗体制备的免疫球蛋白上。可以用放射性标记也可以利用产生荧光或化学光的非放射性标记。

    c) 基因表达的问题

    免疫检测依赖于克隆基因的表达,然而一种生物的基因在不同的生物中可能不表达。特别是动物或植物(叶绿体除外)的基因在大肠杆菌中表达的可能性极小。

    可以利用特殊的载体,称为表达载体来解决这一问题,表达载体是为在细菌细胞中启动克隆的基因表达而设计的。将动物基因克隆到表达载体,然后重组到E. coli中进行免疫筛选是非常有效的,已经获得了多个重要的激素基因。

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