上海远慕生物科技有限公司
所在位置: 首页 > 新闻中心 > 如何选择正确内参抗体,这些你需知道!

如何选择正确内参抗体,这些你需知道!

上海远慕生物科技有限公司
发布时间:2020/4/20 11:11:10

内参抗体可用于评价蛋白质免疫印迹法(Western Blot)的效率,比较凝胶中每孔的蛋白上样量。此类对照可帮助确定样品间表达水平的差异,以判断是由细胞裂解物的实际蛋白水平导致,还是由上样量的差异导致。

内参抗体在目标蛋白的免疫荧光研究中,也可以作为共染的阳性对照。内参抗体分为未标记型和标记型,标记物包括生物素、HRP、FITC、PE、Cy染料和Alexa Fluor染料。

内参抗体种类很多,比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Vinculin、Lamin B、PCNA等,其选择常使我们困惑。本文将简单介绍选择内参抗体应遵循的五项原则:

一、样本种属来源:

首先要考虑实验样本来源于什么物种。

1. 哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。

2. 植物来源实验样本,则可以选择plant actin、Rubisco等。

3. 其他来源样本研究较少,所以就应该参照文献报导,选择合适的蛋白作为内参。

二、分子量大小:

选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小,一般保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。例如,目的蛋白分子量为40KD,此时不适宜选择β-actin、与GAPDH作为内参,可以考虑选择α-Tubulin或者β-tubulin作为内参。

三、表达水平:

选择的内参蛋白需要在待测样本中是高表达的。常用的内参蛋白是由管家基因高表达的,是细胞发育和维持细胞活力所必须的。例如,细胞核的内参蛋白 PCNA,在 DNA S 期表达,因此对于非增殖细胞不推荐使用。

四、表达因素:

选择蛋白表达不受实验变量影响的内参。

●在做多组织多细胞样本对比表达量时,zui好选用 GAPDH作为内参,因为GAPDH是代谢类蛋白,在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性;

●而在某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参;

●涉及细胞增殖的相关试验中,c-Jun由于自身表达变化不适合做内参;

●凋亡实验时,TBP、Lamin等也不适合作为内参;

●做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,应选择结构蛋白作为内参,如β-Actin 和β-Tubulin;

●做各种分泌液样本的时候,如血浆、乳汁、组织液等,由于没有完整的细胞结构,只能选择一些分泌蛋白作为内参。

阅读人数:128

相关产品

阿仪网wap.demolistic.com

注册即领取38元体验金