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质粒DNA小量制备的问题与对策 @远慕新闻

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发布时间:2020/4/14 14:35:27

质粒DNA小量制备的问题与对策:

    裂解和煮佛法都极其可靠,重复性也很好,而且一般没有会么麻烦。多年来,在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中,只碰到过两个问题:
    1)有些工作者首次进行小量制备时,有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割,这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下,用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在,可用离心柱层析注纯化DNA。
    2)在十分偶然的情况下,个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。
    三、质粒DNA的大量制备
    在丰富培养基中扩增质粒
    细菌的收获和裂解
    收获
    碱裂解法

    (一)在丰富培养基中扩增质粒
    许多年来,一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效,然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中,采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA,而且重复性也很好。
    1)将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素,用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。
    2)将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37℃)施放入25ml对数晚期的培养物,于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分),所得培养物的OD 600值约为0.4。
    3)可做可不做:加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇),使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒,有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复制达到很高的拷贝数,因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理,具有抑制细菌复制的优点,可减少细菌裂解物的体积和粘稠度,极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来,尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便,但用氯霉素处理还是利大于弊。
    4)于37℃剧烈振摇(300转/分),继续培养12-16小时。

    (二)细菌的收获和裂解
    1.收获
    1)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
    2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
    STE
    0.1mol/L NaCl
    10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
    1mmol/L EDTA(pH8.0)
    2)按步骤1)所述方法离心,以收集细菌细胞。
    2,碱裂解法
    1)将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml(18ml)溶液I中。
    溶液I
    50mmol/L葡萄糖
    25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
    10mmol/L EDTA(pH8.0)
    溶液I可成批配制,在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。
    2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时,溶菌酶不能有效工作。
    3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
    溶液Ⅱ
    0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
    1%SDS
    盖紧瓶盖,缓缓颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
    4)加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
    溶液Ⅲ
    5mol/L乙酸钾 60ml
    冰乙酸 11.5ml
    水 28.5ml
    所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。
    封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟,应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。
    5)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧,可以5000转/分再度离心20分钟, 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4)]。
    6)上清过滤至一250ml离心瓶中,加0.6体积的异丙醇,充分混匀,于室温放置10分钟。
    7)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟,回收核酸。如于4℃离心,盐也会了生沉淀。
    8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇,用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴,于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
    9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
    10)纯化。

    四、质粒DNA的纯化
    聚乙二醇沉淀法质粒DNA
    氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA
    (一)聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
    1)将核酸溶液所得]转入15mlCorex 管中, 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
    2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇, 充分混匀, 用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏, 回收沉淀的核酸。
    3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
    4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
    5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
    6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
    7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
    8)吸去上清,加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
    9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
    10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD 260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml), 然后将DNA贮于-20℃。

    (二)氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA
    此方法可获的较高质量的质粒DNA,但耗时且费用昂贵目前较少采用,这里不多缀述。

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