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细胞复苏失败的原因分析 远慕新闻√

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发布时间:2019/11/15 9:39:21

问:以前拿回细胞后,传代、冻存后复苏过几次都没什么问题,最近因实验室孵箱污染,清洁消毒细胞室后,重新复苏,结果连续复苏6支,细胞均未贴壁,今晚复苏6小时后观察有一瓶相对贴壁细胞数较之前复苏失败瓶多,但贴壁细胞状态不好,形态不佳,透光度亦不好!急求各位大侠会诊指导!

答:juventus2004认为复苏过程没有问题,是否是从液氮拿出直接放入温水,还有培养箱,二氧化碳浓度,培养基、PH值等环节。要么加高浓度FBS 15-20%,看看能否帮助贴壁,当然也需要考虑血清问题,还有确信拿来的细胞没问题。
 

pcspc9认为首先应该怀疑冻存,实际上复苏出问题的可能非常小,因为操作简单,而且死板。

1、你冻存的时候是不是消化的时间过长,这是一般人所注意不到的,即使书上也不讲这个问题,但我因为这个问题就两种肺癌细胞和一种肝癌细胞专门做过试验,这个绝对是绝大部分人细胞复不活的一个原因。太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力,表现为先贴后死,原因是在你复苏的时候细胞已进入凋亡程序,不可逆转的死亡。

2、你的冻存液好不好,是什么,甘油还是DMSO,质量非常重要,否则也会死亡。

3、你的冻存液的量加的是不是太多,ATCC推荐是不超过7%,大于5%,太多也不好。

4、你在冻存的时候是不是把DMSO混均匀,这个有一些影响,但不算太大。

5、你的冻存是否按部就班,就是所温度梯度是不是把握严格,很多人容易忘却这个事情,因为这个东西流程长。

6、如果你细胞污染,你是否能很快看到,我比我的导师能早一天看到污染。从这个角度讲建议去除离心这步。

7、你的细胞在冻存前是否过密。

还有,我是不赞成孵箱污染这个概念的,所有在一个孵箱里的细胞都污染一个细菌的话,这个细菌是源于孵箱的,但这不代表孵箱污染,因为孵箱无论你如何处理都有大量的细菌,问题在操作。我们的细胞房不换拖鞋,非常脏,别人的细胞都污染,很多细胞都污染到绝种,但我的只污染一次(两年内只有两瓶),那次是因为别人给我动了,我每次细胞摆放顺序都是记住的。如果你老怀疑孵箱污染,那说明你在养细胞这方面很差。

每次污染的原因都要尽可能的找,以后就不犯同样的问题,这个很重要,不能靠猜,否则你就有可能细胞养绝最后换课题,这个我见得太多了,别不当会事。

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